SELEX-Technologieentwicklung im Hochdurchsatz
Le résumé fourni par la source
Der SELEX-Prozess zur Selektion funktioneller Nukleinsäuren (hier: Aptamere) ist, obgleich mittlerweile vielfach modifiziert, noch immer ein zeit- und damit kostenintensives Verfahren. Eine parallele Selektion von DNA-Aptameren in 10 Runden gegen Streptavidin wurde halbautomatisiert, und zunächst nach herkömmlichen Protokollen (Klonierung, Sanger- Sequenzierung), durchgeführt und anschließend mithilfe einer massiv parallelen Sequenzierungstechnologie (next-generation sequencing) aller Runden eingehender analysiert. Auf drei Runden reduzierte und optimierte SELEX-Protokolle wurden für zwei weitere Streptavidin-Aptamer-Selektionen im Zuge dieser Arbeit entwickelt, die möglichen Binder über next-generation sequencing identifiziert. Angereicherte Sequenzen sind in geeigneten Bindungsstudien in der Form von vollsynthetischen Oligonukleotiden hinsichtlich ihrer Zielmolekül-Affinität charakterisiert worden. Im Hinblick auf eine mögliche kommerzielle Verwertbarkeit wurde die Affinitätschromatographie von rekombinanten Streptavidin und eines Fusionsproteins als beispielhafte Anwendung von Aptameren in der Biotechnologie gewählt. Amplifikationsreaktionen besonders hoch diverser Nukleinsäuregemische, wie sie bei SELEXExperimenten zum Einsatz kommen, bergen das Risiko der Artefaktentstehung. Die in vitro- Kompartimentierung der PCR durch Wasser-in-Öl-Emulsionen erlaubte hingegen eine nahezu klonale Amplifikation ohne Artefakte. Eine Optimierung des RNA-SELEX-Prozesses erfolgte durch die Verwendung der Qβ-Replikase zur isothermalen RNA- Amplifikation. Üblicherweise auftretende Kontaminationen wurden durch das Emulgieren (Wasser-in-Öl-Emulsionen) der Reaktionen verhindert. Hierdurch konnten die zeitaufwendigen Arbeitsschritte reverse Transkription, PCR und in vitro-Transkription eingespart werden. Der Flaschenhals von der parallelen SELEX über Einzelklonsequenzierung, Sequenzauswertung und der Bindungsstudien einzelner Klone konnte durch die Ergebnisse dieser Arbeit erfolgreich geweitet werden. Hinsichtlich der zielgerichteten Generierung von Aptameren werden nachfolgende Studien sicherlich von den gewonnenen Erkenntnissen profitieren können.
Ce résumé expose les affirmations des auteurs. BNTIC ne l’interprète pas comme une validation indépendante des résultats.