Nested PCR to optimize rpoB metabarcoding for low-concentration and host-associated bacterial DNA
Rattachement africain : fr, Maroc, in. Niveau de preuve : code pays fourni par la source.
Le résumé fourni par la source
ABSTRACT Housekeeping genes have proven to be effective taxonomic markers for characterizing bacterial microbiota in short-read amplicon metabarcoding studies. A region of the rpoB gene has been shown to minimize Operational Taxonomic Unit (OTU) overestimation bias with a high degree of accuracy, providing better species-level taxonomic resolution (J.-C. Ogier, S. Pagès, M. Galan, M. Barret, and S. Gaudriault, S., BMC Microbiol. 19:171, https://doi.org/10.1186/s12866-019-1546-z ). However, the primers for rpoB are highly degenerate, leading to potential problems in the amplification of bacterial DNA present at low concentration in the sample or embedded within eukaryotic matrices, as for the host-associated microbiota. We addressed these limitations by using a two-step PCR approach to optimize the rpoB procedure. The first PCR amplifies a region of the rpoB gene with the outer primers, and the second PCR then uses primers incorporating Illumina adapters, the inner primers, to amplify the taxonomic marker for metabarcoding. We first used in silico approaches to evaluate the universality of the outer and inner rpoB primers. We then tested the nested rpoB PCR method on commercial mock samples. The nested PCR approach increased amplification efficiency for dilute samples without biasing the bacterial composition of the mock sample revealed by metabarcoding relative to single-step PCR. We also tested the nested rpoB PCR method on field-collected samples of insects. The nested PCR outperformed single-step PCR, increasing amplification efficiency for bacterial DNA present at low concentrations (insect oral secretions) or embedded in eukaryotic DNA matrices (insect larvae). This method provides a promising new strategy for characterizing host-associated microbiota. IMPORTANCE In this study, we improved an existing method for characterizing host-associated bacterial microbiota using a genetic marker targeting a specific subregion of the rpoB gene. The two-step PCR approach enables more efficient amplification of bacterial DNA at low concentrations or within complex host DNA matrices, such as those found in insects. We optimized the cycle number in each PCR step to minimize bias in bacterial community composition, validated through tests on mock communities. This method provides a robust and reliable solution for analyzing host-associated microbiota, enhancing amplification efficiency and improving result accuracy.
Ce résumé expose les affirmations des auteurs. BNTIC ne l’interprète pas comme une validation indépendante des résultats.
Le contrôle bibliographique ouvert
DOI retrouvé dans Crossref DOI retrouvé, mais le titre doit être comparé manuellement.
- Titre Crossref
- Nested PCR to optimize <i>rpoB</i> metabarcoding for low-concentration and host-associated bacterial DNA
- Date Crossref
- 02/09/2025
- Éditeur
- American Society for Microbiology
- Type
- journal-article
Ce recoupement confirme des métadonnées liées au DOI. Il ne confirme ni la méthode ni les conclusions de l’étude, et il ne compte pas comme une seconde source scientifique indépendante.
Où se fait cette recherche
-
Université de Montpellier pays non établi dans la noticeUniversité ou école supérieure
-
Institut National de Recherche pour l'Agriculture pays non établi dans la noticeOrganisme public
-
Diversité pays non établi dans la noticeStructure de recherche
-
Institut Agro Montpelier pays non établi dans la noticeStructure de recherche
-
École Nationale Vétérinaire de Toulouse pays non établi dans la noticeUniversité ou école supérieure
-
Génétique Physiologie et Systèmes d'Elevage pays non établi dans la noticeStructure de recherche
-
Université de Toulouse ENVT pays non établi dans la noticeUniversité ou école supérieure
-
Centre de Coopération Internationale en Recherche Agronomique pour le Développement pays non établi dans la noticeStructure de recherche
-
Institut de Recherche pour le Développement pays non établi dans la noticeOrganisme public
-
Institut National de la Recherche Agronomique Maroc (code pays fourni par la source)Structure de recherche
-
Institute of Bioinformatics pays non établi dans la noticeOrganisation à but non lucratif
-
Genotoul coordination pays non établi dans la noticeStructure de recherche
Université de Montpellier, Institut National de Recherche pour l'Agriculture et Diversité, avec 9 autres affiliations. Pays d’affiliation : Maroc.
Une affiliation ne permet pas de déduire la nationalité d’un auteur.