Producción y caracterización de la superóxido dismutasa a (SodA) de nocardia brasiliensis en pichia pastoris

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Introduccion: A mediados de los anos 70’s del siglo pasado el descubrimiento de la tecnologia del ADN recombinante marca el inicio de la era de la biotecnologia moderna. La implementacion de estas tecnologias permitio la utilizacion de organismos como sistemas de expresion que a lo largo de los anos ha generado la produccion de una gran variedad de productos biologicos. Dentro de estos sistemas Pichia pastoris es un sistema de expresion ampliamente utilizado debido a sus caracteristicas tales como la produccion de proteinas en grandes cantidades, la liberacion de los productos al medio de cultivo, la obtencion de productos complejos que requieren modificaciones postraduccionales tipicas de los eucariotas o que contienen puentes disulfuro, entre otras. Nocardia brasiliensis es una bacteria parcialmente acido-alcohol resistente la cual forma colonias granulares, con hifas aereas escasas, sus colonias exhiben un color anaranjado pardo con bordes en blanco. N. brasiliensis es patogena para el ser humano y es el agente causal del actinomicetoma. El actinomicetoma es una enfermedad cronica generalmente localizada en las extremidades. Se caracteriza por ser un proceso lento de tumefaccion con nodulos, abscesos y fistulas.La Superoxido Dismutasa (SOD) es una enzima reductora polimerica que cataliza la conversion del ion superoxido a peroxido de hidrogeno y oxigeno molecular. La SOD ha sido propuesta como un factor de virulencia de microorganismos patogenos, cuya accion consiste en bloquear los efectores oxidativos del estallido respiratorio iniciado por los fagocitos en el fagolisosoma. Este mecanismo ha sido descrito para bacterias de los generos Mycobacterium, Rhodococcus y Nocardia. Objetivo: producir y caracterizar la Superoxido Dismutasa A (SODA) de Nocardia brasiliensis en Pichia pastoris. Metodologia: se realizo el diseno de primers adicionando secuencias de sitios de corte para las enzimas XhoI y AvrII, asi como una cola de histidinas en el extremo 5’ para la amplificacion del gen sodA de N. brasiliensis a partir del ADN genomico de Nocardia brasiliensis. El amplicon se clono en el vector de expresion pPIC9. Se llevo a cabo la transformacion por electroporacion de levaduras Pichia pastoris GS115. La produccion de SOD se llevo a cabo en inducciones de 96 h con metanol como agente inductor. Los sobrenadantes se dializaron con membranas de celulosa. Los dializados se observaron por SDS-PAGE y western blot. Se analizo la actividad funcional de la enzima con el SOD Assay kit de Sigma Aldrich. Resultados: Por reaccion en cadena de la polimerasa se obtuvo una secuencia de 625 pb correspondiente al gen sodA. El fragmento se ligo al vector de expresion pPIC9 y fue caracterizado con las enzimas de restriccion XhoI y AvrII. Las cepas trasformadas de P. pastoris GS115 se caracterizaron con el gen aox1 obteniendo cepas Mut+ y Muts. Los analisis por SDSPAGE mostraron bandas no observadas en el control negativo de expresion mientras en los western blot solo una de las clonas mostro senal. Los analisis de actividad funcional sugieren inhibicion de la reaccion enzimatica infiriendo presencia de la proteina SOD en el medio dializado. Conclusiones: Se logro la construccion del sistema de expresion Pichia pastoris con el casete de expresion de la SOD de N. brasiliensis. Asi como la generacion de cepas Mut+y Muts. En los ensayos de actividad funcional se observo inhibicion de la reaccion enzimatica.

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